Production d'IgG1 Fc humain recombinant avec N bénéfique

Communications Biology volume 6, Article number: 589 (2023) Citer cet article

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L'immunoglobuline intraveineuse (IgIV) est une IgG polyclonale dérivée du plasma utilisée pour le traitement des maladies auto-immunes. Des études montrent que l'α-2,6 sialylation du Fc améliore l'activité anti-inflammatoire. De plus, l'afucosylation du Fc bloque efficacement le FcγRIIIA en augmentant l'affinité monovalente pour ce récepteur, ce qui peut être bénéfique pour le traitement de la thrombocytopénie immunitaire réfractaire (ITP). Ici, nous avons généré des poulets modifiés sur le génome qui synthétisent le Fc IgG1 humain dans le foie et sécrètent le Fc IgG1 humain α-2,6 sialylé et faiblement fucosylé (rhIgG1 Fc) dans le sérum et le jaune d'œuf. En outre, rhIgG1 Fc a une plus grande affinité pour FcγRIIIA que les IVIG commerciales. Ainsi, rhIgG1 Fc inhibe efficacement la réticulation FcγRIIIA médiée par le complexe immun et la réponse ADCC subséquente. De plus, le rhIgG1 Fc exerce une activité anti-inflammatoire dans un modèle ITP passif, démontrant que le rhIgG1 Fc dérivé du foie de poulet a récapitulé avec succès l'efficacité des IVIG. Ces résultats montrent que les poulets dont le génome a été modifié peuvent être utilisés comme plate-forme de production de rhIgG1 Fc avec un schéma de N-glycosylation bénéfique pour les activités anti-inflammatoires.

Les maladies auto-immunes (MA) sont causées par une réponse immunitaire aberrante contre les auto-antigènes1. Généralement, les auto-anticorps qui reconnaissent les auto-antigènes déclenchent des réponses inflammatoires en activant les cellules effectrices telles que les macrophages, les neutrophiles et les cellules tueuses naturelles, entraînant la destruction des tissus ou des cellules2. Par conséquent, pour traiter les AD, il est important d'inhiber l'activation des cellules effectrices et d'atténuer les réponses inflammatoires. L'immunoglobuline intraveineuse (IgIV) anti-inflammatoire est largement utilisée pour traiter les AD inflammatoires3. Lorsque les IgIV sont perfusées à fortes doses (c.-à-d. 1 à 2 g/kg), elles peuvent améliorer l'inflammation et rétablir le nombre de plaquettes chez les patients atteints de thrombocytopénie immunitaire (PTI)4. Étant donné que les IgIV présentent une activité anti-inflammatoire contre de nombreux AD, la demande mondiale augmente continuellement5. Cependant, étant donné que les IgIV sont préparées à partir de plasma humain donné, les pénuries d'approvisionnement et les coûts élevés sont des limitations majeures6. Par conséquent, il est souhaitable de développer un système efficace pour la production et la fourniture d'alternatives aux IVIG qui récapitulent l'activité anti-inflammatoire des IVIG dérivées du plasma.

Bien que l'IVIG agisse via divers mécanismes, son fragment Fc est essentiel pour l'activité anti-inflammatoire7,8,9. On sait que le Fc α-2,6 sialylé favorise l'expression du FcγRIIB dans les macrophages effecteurs en favorisant la sécrétion de cytokines TH2 telles que l'IL-33 et l'IL-4, et le rapport abondant de Fc α-2,6 sialylé augmente l'anti- activité inflammatoire des IgIV significativement10,11,12,13,14,15. Par conséquent, le Fc hautement α-2,6 sialylé est une alternative potentielle aux IgIV qui présente une activité anti-inflammatoire accrue.

L'autre mécanisme majeur sous-jacent à l'activité des IgIV est le blocage compétitif de l'activation des récepteurs Fcγ (FcγRs)7,16. Lorsque les IgIV sont administrées à fortes doses, elles occupent les FcγR activateurs et empêchent les complexes immuns de se lier et de réticuler ces récepteurs17,18. En particulier, l'activité anti-inflammatoire des IVIG est dépendante du FcγRIIIA, ce qui suggère que le blocage du FcγRIIIA est un mécanisme potentiel de l'activité des IVIG19,20,21. Cette notion est étayée par une étude montrant que le blocage du FcγRIIIA par des anticorps monoclonaux récapitule l'activité des IVIG et améliore efficacement les réponses inflammatoires chez les patients PTI réfractaires, bien que la réticulation du FcγRIIIA entraîne des effets secondaires indésirables22. Étant donné que l'absence de fucosylation centrale (afucosylation) augmente considérablement l'affinité monovalente de l'IgG pour le FcγRIIIA23, on peut supposer que le Fc afucosylé occupera efficacement le FcγRIIIA et sera bénéfique pour induire une activité anti-inflammatoire et le traitement du PTI réfractaire. Récemment, il a été démontré que le FcγRIIIA des cellules NK était abondamment occupé par des IgG24 afucosylées. De plus, il a été montré que les anticorps afucosylés antigéniques bloquent efficacement le FcγRIIIA et peuvent être anti-inflammatoires en inhibant les fonctions effectrices Fc de l'anticorps spécifique de l'antigène25.

Par conséquent, si nous pouvons générer une région hIgG1 Fc qui a des niveaux élevés de N-glycanes α-2,6 sialylés et qui a simultanément une affinité élevée pour FcγRIIIA via l'afucosylation, nous pouvons déclencher les multiples modes d'action de l'IVIG, améliorant ainsi l'anti- activité inflammatoire. Cependant, les IgIV dérivées du plasma contiennent de faibles quantités de Fc sialylé (environ 10 % des N-glycanes totaux) et une grande proportion de N-glycanes fucosylés26. Le hIgG1 Fc recombinant dérivé de la culture de cellules de mammifères a également de faibles niveaux de glycanes sialylés et des niveaux élevés de glycanes fucosylés à moins que des modifications spécifiques ne soient apportées aux lignées cellulaires d'expression27. Par conséquent, un système alternatif pour la production de hIgG1 Fc contenant une proportion élevée de N-glycanes α-2,6 sialylés et afucosylés est nécessaire pour le développement d'une alternative IVIG avec une activité anti-inflammatoire renforcée.

Les poulets sont une plate-forme efficace pour la production de produits biopharmaceutiques ; en effet, les œufs de poule contiennent d'abondantes protéines et les poules pondent plus de 300 œufs par an28. En outre, le schéma de glycosylation des protéines d'œuf de poule est similaire à celui des protéines humaines et, plus important encore, les poulets ne produisent que des glycanes de type humain et ne produisent pas d'α-galactose et de Neu5Gc28,29 immunogènes. Pour ces raisons, diverses approches visant à augmenter l'accumulation de produits biopharmaceutiques dans les œufs, en particulier les blancs d'œufs, ont été étudiées30,31,32,33,34,35,36,37. Pendant ce temps, la majorité des protéines du jaune d'œuf sont synthétisées à partir du foie et transférées de la circulation sanguine lorsque le jaune commence à mûrir dans l'ovaire. Le foie de poulet exprime des niveaux élevés d'α-2,6 sialyltransférase (ST6GAL1), et on suppose que le foie de poulet a de très faibles niveaux de fucosyltransférase (FUT8); en effet, la plupart des N-glycanes présents dans les protéines de jaune d'œuf sont afucosylés38,39. Par conséquent, on s'attend à ce que les protéines synthétisées dans le foie de poulet aient une structure N-glycane hautement α-2,6 sialylée et afucosylée, et que ces protéines circulent dans la circulation sanguine et, finalement, s'accumulent dans le jaune d'œuf40. Par conséquent, si hIgG1 Fc peut être synthétisé de manière spécifique au foie de poulet, hIgG1 Fc peut être obtenu à partir de sérum et de jaune d'œuf avec des niveaux élevés d'α-2,6 sialylation et d'afucosylation, ce qui sera bénéfique pour l'activité anti-inflammatoire.

Nous rapportons ici le développement de poulets dont le génome a été modifié et qui sécrètent le Fc IgG1 humain de manière spécifique au foie. Pour ce faire, nous avons étiqueté la séquence codante de l'IgG1 Fc humaine au gène de l'albumine (ALB), qui est une protéine sérique majeure et exprimée dans le foie, et nous avons généré des poulets à génome modifié (ci-après appelés poulets ALB :: hIgG1 Fc) . Pour le marquage, nous avons utilisé le peptide 2A d'autoclivage du virus asigna (T2A) entre les séquences codantes ALB et IgG1 Fc, ainsi IgG1 Fc peut être séparé de ALB après traduction. En utilisant cette stratégie, nous avons produit efficacement des IgG1 Fc humaines hautement α-2,6 sialylées et afucosylées dans du sérum de poulet et, finalement, dans du jaune d'œuf. L'IgG1 Fc humain recombinant (rhIgG1 Fc) dérivé de poulets ALB :: hIgG1 Fc a amélioré l'activité de blocage de FcγRIIIA et a récapitulé avec succès les activités anti-inflammatoires de l'IVIG in vivo. Par conséquent, nous montrons ici que les poulets dont le génome a été modifié et qui expriment hIgG1 Fc de manière spécifique au foie peuvent être une source alternative potentielle d'IgIV au plasma humain.

Pour accumuler le rhIgG1 Fc dans le sérum et le jaune d'œuf, nous avons généré de l'albumine (ALB)::hIgG1 Fc des poulets modifiés du génome à l'aide de la technologie d'édition du génome médiée par CRISPR/Cas9-NHEJ dans les cellules germinales primordiales (PGC) White Leghorn (WL) comme indiqué précédemment41 ,42. Pour introduire la séquence codante hIgG1 Fc (CDS) dans le gène ALB, nous avons construit un plasmide CRISPR/Cas9 qui reconnaît l'intron 13 du gène ALB, et un plasmide donneur contenant l'intron 13 et l'exon 14 (sans le codon stop) de l'ALB gène, suivi de la séquence T2A et du CDS hIgG1 Fc, qui contient la charnière hIgG1 et les domaines CH2 et CH3 (Fig. 1a). T2A est l'un des peptides viraux d'autoclivage 2A qui induisent l'absence de formation de liaison peptidique lors de la traduction, permettant ainsi l'expression simultanée de deux protéines différentes43. Bien que l'efficacité de clivage des peptides 2A n'était pas de 100 %44, nous avions l'intention de séparer le rhIgG1 Fc de l'ALB en utilisant T2A sans affecter la formation et la sécrétion d'ALB, empêchant ainsi l'effet nocif inconnu causé par l'épuisement de l'ALB.

a Illustration schématique du plasmide donneur contenant la séquence codante de l'IgG1 Fc humain (hIgG1 Fc) pour le marquage du gène de l'albumine (ALB). Le vecteur donneur comprend l'intron ALB 13, l'exon ALB 14 sans le codon d'arrêt, la séquence T2A, la séquence codante du peptide signal ALB (sig pep), la séquence codante hIgG1 Fc, l'ALB 3' UTR et une résistance à la puromycine (PuroR) gène. Lorsque le vecteur donneur et l'ARN guide unique (sgRNA), qui cible l'intron 13 de l'ALB, ont été co-transfectés dans des cellules germinales primordiales (PGC), le vecteur donneur a été inséré dans le site cible du sgRNA. L'allèle modifié résultant contient l'exon ALB 14 sans le codon d'arrêt, la séquence codante T2A, la séquence codante du peptide signal ALB et la séquence codante hIgGl Fc. b Validation knock-in (KI) des PGC après sélection de la puromycine à l'aide d'amorces spécifiques de la jonction 5 'et de la jonction 3'. c Analyse de séquence de trois produits de PCR clonés en TA de la jonction 5' et de la jonction 3' de PGC éditées sur le génome. d Production d'une descendance dérivée de la PGC du donneur par testcross. e Analyse de séquence de trois produits de PCR clonés par TA de la jonction 5' et de la jonction 3' de trois descendants G1 modifiés par le génome ALB ::hIgG1 Fc.

Après transfection des plasmides CRISPR/Cas9 et donneurs, les PGC modifiés par le génome ont été sélectionnés par sélection à la puromycine. L'intégration du plasmide donneur dans des PGC sélectionnés a été validée par PCR et analyse de la séquence de la jonction 5' et 3' entre les séquences plasmidiques endogènes et donneurs ; cela a confirmé que le plasmide donneur avait été intégré avec succès au site cible, avec plusieurs indels (Fig. 1b, c). Ces PGC WL établies et éditées sur le génome ont été transplantées dans des embryons receveurs coréens Ogye (KO). Après maturation sexuelle, deux mâles KO receveurs ont été testés croisés avec des poules WL de type sauvage et la progéniture G1 dérivée de PGC du donneur a éclos (Fig. 1d et Tableau supplémentaire 1). À partir de la progéniture G1 dérivée de la PGC du donneur, nous avons obtenu une descendance ALB :: hIgG1 Fc dans laquelle l'intégration du plasmide donneur a été validée par PCR spécifique aux jonctions 5' et 3' et analyse de séquence de l'ADN génomique. Dans la descendance modifiée du génome, le plasmide donneur a été intégré avec succès, avec une mutation d'insertion d'une paire de bases aux sites de jonction 5 'et 3' (Fig. 1e).

Ensuite, un coq G1 hétérozygote sexuellement mature (ALB+/hIgG1 Fc) a été accouplé avec des poules de type sauvage (ALB+/+) et des descendants G2 ALB :: hIgG1 Fc (ALB+/hIgG1 Fc) ont éclos. Après maturation sexuelle, ces descendants hétérozygotes G2 ont été accouplés et les descendants G3 ont éclos avec succès. Le génotypage de la descendance G3 a confirmé que la descendance homozygote ALB :: hIgG1 Fc (ALB hIgG1 Fc / hIgG1 Fc) avait été générée avec succès selon l'hérédité mendélienne (Fig. 1a, b supplémentaires). Bien que la concentration d'ALB dans le sérum ait tendance à diminuer chez les poulets homozygotes, nous avons observé que les poulets homozygotes sécrètent également de l'ALB dans le sang, sont en bonne santé, atteignent la maturité sexuelle et pondent des œufs (Fig. 2a – c, e supplémentaires). Ces résultats démontrent que les poulets ALB::hIgG1 Fc peuvent être produits avec succès, qu'ils atteignent la maturité sexuelle et pondent des œufs.

Pour identifier le profil d'expression des transcrits hIgG1 Fc chez les poulets ALB :: hIgG1 Fc, nous avons extrait l'ARN de plusieurs organes et confirmé l'expression des transcrits hIgG1 Fc par RT-PCR. En conséquence, nous avons identifié une forte expression des transcrits de rhIgG1 Fc dans le foie (Fig. 2a), ce qui suggère que rhIgG1 Fc a été transcrit avec succès de manière spécifique au foie.

a Validation de l'expression du transcrit hIgG1 Fc par RT-PCR de tissus de plusieurs organes obtenus à partir de poulets de type sauvage et ALB::hIgG1 Fc genome edited. b Validation de la sécrétion de rhIgG1 Fc dans le sérum et le jaune d'œuf de poulets dont le génome a été modifié par ALB :: hIgG1 Fc par Western blot. Du β-mercaptoéthanol a été ajouté aux échantillons pour rompre les liaisons disulfure (conditions réductrices). Le sérum de poulet de type sauvage a été utilisé comme contrôle négatif. c Concentration de rhIgG1 Fc dans le sérum de poussins hétérozygotes ALB+/hIgG1 Fc à 4, 18 et 40 semaines après l'éclosion. Chaque point représente des poulets individuels. (n = 5–12 d'échantillons indépendants) d Concentration de rhIgG1 Fc dans les jaunes d'œufs hétérozygotes ALB+/hIgG1 Fc à 24, 30 et 36 semaines après l'éclosion. Chaque point représente des jaunes d'œufs individuels. (n = 6-8 d'échantillons indépendants) Les différences entre les groupes ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle. ns, non significatif. Les barres d'erreur représentent l'écart type.

Ensuite, nous avons prélevé du sérum et du jaune d'œuf et validé la sécrétion de rhIgG1 Fc par western blot (Fig. 2b). Les données ont confirmé la sécrétion de hIgG1 Fc dans la circulation sanguine et le jaune d'œuf (Fig. 2b). Dans des conditions non réductrices, une bande compatible avec rhIgG1 Fc ((CH2 + CH3)2) a été détectée à la fois dans le sérum et le jaune. Dans des conditions réductrices, une bande d'environ 35 kDa a été détectée, ce qui est plus grand que la masse moléculaire attendue de CH2 + CH3 déglycosylé (25 kDa) (Fig. 2b). Ce résultat montre que le rhIgG1 Fc est sécrété dans le sérum et le jaune d'oeuf sous sa forme glycosylée. Fait intéressant, dans le sérum, une large bande d'environ 110 kDa (cohérente avec la masse moléculaire de ALB + T2A + CH2 + CH3) a également été détectée dans des conditions réductrices, ainsi que la fusion ALB-Fc (une large bande de > 100 kDa ) dans des conditions non réductrices, suggérant que le clivage T2A n'a pas été complètement réalisé (Fig. 2b). Contrairement au sérum, seul le rhIgG1 Fc a été détecté dans le jaune d'œuf dans des conditions réductrices et non réductrices (Fig. 2b).

Ensuite, nous avons vérifié la concentration de rhIgG1 Fc dans le sérum et le jaune d'œuf de poules hétérozygotes G2 ALB+/hIgG1 Fc. La concentration moyenne de rhIgG1 Fc dans le sérum des descendants hétérozygotes ALB+/hIgG1 Fc à 4, 18 et 40 semaines après l'éclosion était de 170,70 ± 71,65 (n = 8) μg/ml, 162,98 ± 27,34 (n = 12) μg/ml, et 149,39 ± 42,34 μg/ml (n = 5), respectivement (Fig. 2c). La concentration de rhIgG1 Fc dans le jaune d'œuf de poules hétérozygotes G2 ALB+/hIgG1 Fc a montré une moyenne de 152,85 ± 85,87 (n = 7) μg/ml, 149 ± 45,52 (n = 8) μg/ml et 143,89 ± 55,57 (n = 6) μg/ml à 24, 30 et 36 semaines, respectivement (Fig. 2d). De plus, nous avons confirmé que le rhIgG1 Fc est sécrété dans la circulation sanguine en continu, quelle que soit la descendance sur plusieurs générations (tableau supplémentaire 2). De plus, nous avons observé que le rhIgG1 Fc est également sécrété et accumulé dans le sérum et le jaune de poules homozygotes ALBhIgG1 Fc / hIgG1 Fc (Fig. 2d et e supplémentaires). Ces résultats montrent que les poulets ALB::hIgG1 Fc sécrètent efficacement rhIgG1 Fc dans le sérum et le jaune d'œuf.

Pour examiner le schéma de N-glycosylation sur le rhIgG1 Fc dérivé de poulets ALB :: hIgG1 Fc, nous avons purifié le rhIgG1 Fc à partir de sérum et de jaune d'œuf en utilisant la chromatographie d'affinité et d'exclusion de taille de la protéine A. rhIgG1 Fc a été purifié avec succès à partir du sérum et du jaune d'œuf. (Fig. 3a). Ensuite, les N-glycanes ont été éliminés par digestion avec la PNGase F et analysés par UPLC-MS/MS. Dans le cas du rhIgG1 Fc purifié à partir de sérum, nous avons identifié six types de N-glycanes, et tous étaient des formes complexes bi-antennaires et afucosylées (Fig. 3b – d). A partir de ce profil de N-glycanes, nous avons déterminé le pourcentage de N-glycanes individuels (tableaux 1 et 2). Le sérum de poulets juvéniles femelles et mâles comprenait environ 2, 5% de glycoformes G0 dégalactosylées, tandis que la majorité des N-glycanes étaient galactosylés et sialylés en phase terminale (Fig. 3b et Tableau 1). Parmi ceux-ci, la composition totale des N-glycanes dans le sérum juvénile féminin et masculin contenant des résidus terminaux d'acide sialique était de 36, 01% et 39, 00%, respectivement (tableau 1). De même, dans le sérum féminin et masculin adulte, la glycoforme G0 dégalactosylée était présente à environ 3, 3% et l'acide sialique terminal était présent à environ 28, 66% et 34, 44%, respectivement (Fig. 3c et Tableau 1). Ces résultats montrent que les poulets ALB::hIgGl Fc sécrètent des taux plus élevés de rhIgGl Fc sialylé et afucosylé dans le sérum.

un rhIgG1 Fc a été purifié à partir de sérum et de jaune en utilisant une colonne de protéine A et une chromatographie d'exclusion de taille. Le rhIgGl Fc purifié a été passé sur un gel SDS-PAGE à 10 %, qui a ensuite été coloré avec une solution de bleu brillant de Coomassie. b Le profil de N-glycosylation de rhIgG1 Fc purifié à partir de sérum juvénile, c de sérum adulte et d de jaune d'œuf à 24 et 40 semaines, tel qu'analysé par UPLC-MS/MS. e Lectine de Sambucus nigra (SNA) et lectine de Maackia amurensis II (MAL II) transfert de rhIgG1 Fc purifié à partir de sérum et de jaune d'œuf. L'érythropoïétine recombinante dérivée de cellules CHO (EPO) qui ne contient que de l'acide sialique a-2,3 a été utilisée comme témoin négatif pour le transfert SNA et comme témoin positif pour le transfert MAL II.

Ensuite, nous avons analysé rhIgG1 Fc purifié à partir de jaune d'œuf à 24 et 40 semaines. Initialement, nous nous attendions à ce que le profil N-glycane de rhIgG1 Fc dans le jaune d'œuf soit le même que celui du sérum car les protéines de jaune d'œuf sont transportées à partir du sérum. Bien que les principaux types de N-glycanes soient les mêmes que dans le sérum, nous avons identifié cinq autres types mineurs de N-glycanes : A3G1F, M3G1S1, M5A1S1F, A3G2S1F et M9. Ceux-ci représentaient 6, 04% et 10, 99% des N-glycanes totaux dans le jaune d'oeuf à 24 et 40 semaines, respectivement (Fig. 3d et Tableau 2). Parmi ceux-ci, les N-glycanes fucosylés centraux étaient présents à raison de 3,53 % et 5,71 % des N-glycanes totaux à 24 et 40 semaines, respectivement (tableau 2). Le pourcentage de rhIgG1 Fc N-glycanes contenant des résidus terminaux d'acide sialique était de 32,07 % et 30,77 % à 24 et 40 semaines, respectivement (tableau 2). Ces résultats montrent que le profil N-glycane de rhIgG1 Fc dans le jaune d'oeuf est largement le même que celui dans le sérum, mais avec quelques différences mineures.

Ensuite, pour identifier le principal type de liaison entre l'acide sialique terminal et les résidus de galactose, qui est l'un des principaux facteurs sous-jacents à l'activité anti-inflammatoire de hIgG1 Fc11, nous avons effectué un transfert de lectine à l'aide de lectine de Sambucus nigra marquée au HRP (SNA) et Maackia amurensis la lectine II (MAL II), qui se lie spécifiquement aux résidus d'acide sialique à liaison α-2,6 et α-2,3, respectivement. Les transferts de SNA ont révélé un signal fort pour le sérum et le jaune rhIgG1 Fc. Cependant, le transfert MAL II a montré un signal négligeable pour le rhIgG1 Fc sérique et jaune, suggérant que le type de liaison principal est α-2,6 (Fig. 3e). Ces résultats montrent que des niveaux élevés de rhIgG1 Fc α-2,6 sialylé et afucosylé peuvent être synthétisés efficacement par des poulets ALB::hIgG1 Fc et purifiés à partir de sérum et de jaune d'œuf.

De plus, la demi-vie sérique de ALB :: hIgG1 Fc rhIgG1 Fc dérivé de poulet, Fc recombinant dérivé de cellules HEK293T et IVIG a été analysée chez la souris C57BL / 6. En conséquence, la demi-vie de ALB :: hIgG1 Fc rhIgG1 Fc dérivé de poulet et Fc recombinant dérivé de cellules HEK293T a été déterminée à 39, 14 et 36, 37 h, respectivement (Fig. 3 supplémentaire).

Étant donné que diverses activités biologiques de l'IgG1 sont dues à l'interaction entre sa région Fc et les récepteurs Fcγ (FcγR), nous avons mesuré la constante de dissociation (KD) pour la liaison de rhIgG1 Fc aux récepteurs humains de type I Fcγ (FcγRIA, FcγRIIA et FcγRIIIA), ICAM spécifique aux cellules dendritiques capturant la non-intégrine (DC-SIGN) (un récepteur pour le Fc α-2,6-sialylé) et le FcRn, par résonance plasmonique de surface (SPR). Les valeurs de KD pour la liaison de rhIgG1 Fc à FcRn, FcγRIA et FcγRIIIA étaient de 9,088 × 10-9, 1,275 × 10−9 et 9,980 × 10−9 M, respectivement (Fig. 4a). Cependant, les valeurs de KD pour la liaison de rhIgG1 Fc à FcγRIIA et DC-SIGN n'ont pas pu être déterminées, principalement en raison d'une liaison non spécifique et d'une faible affinité (Fig. 4 et tableau 3 supplémentaires). De plus, nous avons mesuré les valeurs de KD pour la liaison des IVIG commerciales à FcRn, FcγRIA et FcγRIIIA : elles étaient respectivement de 2,142 × 10−8, 2,480 × 10−9 et 2,870 × 10−7 M (Fig. 4a) . À partir des valeurs KD évaluées, nous avons confirmé que l'affinité de rhIgG1 Fc pour FcγRIA et FcRn était respectivement 1, 94 et 2, 35 fois supérieure à celle des IVIG commerciales (tableau 3). En particulier, l'affinité de rhIgG1 Fc pour FcγRIIIA était 28,75 fois supérieure à celle des IVIG commerciales (tableau 3). Ces résultats suggèrent que rhIgG1 Fc a une affinité monovalente significativement plus élevée pour FcγRIIIA que IVIG, très probablement en raison de ses niveaux élevés d'afucosylation.

a Sensorgrammes montrant la liaison d'IVIG et de rhIgG1 Fc à FcRn, FcγRIA et FcγRIIIA (analyse Biacore). La liaison a été évaluée à l'aide d'un modèle d'équilibre à l'état d'équilibre pour le FcRn et d'une cinétique à cycle unique pour le FcγRIA et le FcγRIIIA. Les valeurs KD sont annotées sur chaque sensorgramme. b Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) d'un anticorps anti-CD20 contre les lymphoblastes B humains WIL2-S en présence d'IVIG et de rhIgG1 Fc. Des cellules Jurkat exprimant FcγRIIIA ont été ajoutées en tant que cellules effectrices et l'activité ADCC a été évaluée en mesurant l'activité de la luciférase. c Phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) d'un anticorps anti-CD20 contre les cellules de lymphome humain Raji en présence d'IVIG et de rhIgG1 Fc. Des cellules Jurkat exprimant FcγRIIA ont été utilisées comme cellules effectrices, et l'activité ADCP a été évaluée en mesurant l'activité de la luciférase. (n = 3 des échantillons indépendants) Les différences entre les groupes ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle. ns, non significatif ; *P < 0,05 ; et *** P < 0,001. Les barres d'erreur représentent l'écart type.

Étant donné que la réticulation du FcγRIIIA par des complexes immuns stimule les cellules immunitaires à sécréter des cytokines inflammatoires et à induire des lésions tissulaires, le blocage du FcγRIIIA est une stratégie anti-inflammatoire puissante ; en effet, l'activité anti-inflammatoire des IVIG est médiée par le blocage de FcγRIIIA via la région Fc19,21,45,46,47. Par conséquent, nous avons demandé si rhIgG1 Fc inhibait la réticulation médiée par le complexe immun de FcγRIIIA et l'activation ultérieure des cellules immunitaires. Pour ce faire, nous avons examiné l'activité ADCC médiée par le FcγRIIIA humain d'un anticorps anti-CD20 en présence d'IVIG ou de rhIgG1 Fc. Des cellules lymphoblastiques WIL2-S, qui expriment le CD20 humain, et des cellules Jurkat transgéniques, qui expriment le FcγRIIIA et le gène rapporteur de la luciférase piloté par le facteur nucléaire de l'élément de réponse aux lymphocytes T activés (NFAT), ont été co-incubées avec un anti-CD20 dilué en série anticorps en présence d'IVIG ou de rhIgG1 Fc. La liaison de l'anticorps anti-CD20 immunocomplexé au FcγRIIIA exprimé par les cellules Jurkat induira la réticulation du FcγRIIIA et activera la voie NFAT, entraînant l'expression de la luciférase.

Lorsqu'une IVIG a été ajoutée à 1,8 mg/ml, la valeur EC50 de l'anticorps anti-CD20 était de 83,36 ng/ml, soit 3,46 fois plus élevée que celle mesurée dans le groupe de traitement PBS (Fig. 4b). Cela indique que l'IgIV a une activité de blocage du FcγRIIIA et empêche la réticulation du FcγRIIIA médiée par les complexes immuns. Fait intéressant, lorsque rhIgG1 Fc a été ajouté à 600 μg/ml, le même rapport molaire que 1,8 mg/ml IVIG, la valeur EC50 de l'anticorps anti-CD20 était de 2218,19 ng/ml, soit 26,60 fois plus élevée que celle de l'IVIG -groupe traité (Fig. 4b). Cette différence de changement de pli est cohérente avec la différence d'affinité d'IVIG et de rhIgG1 Fc pour FcγRIIIA (Fig. 4a et Tableau 3). Lorsque la concentration de rhIgG1 Fc a diminué, la valeur EC50 a augmenté proportionnellement (Fig. 4b). Ces résultats indiquent que le rhIgG1 Fc est supérieur aux IVIG commerciales en ce qui concerne l'occupation du FcγRIIIA, et qu'il bloque efficacement la liaison des complexes immuns à ce récepteur.

De plus, nous avons essayé de confirmer que rhIgG1 Fc bloque FcγRIIA, un inducteur majeur de l'ADCP, en utilisant des cellules Jurkat transgéniques qui expriment FcγRIIA et le gène rapporteur de la luciférase piloté par l'élément de réponse NFAT. Les cellules Raji exprimant CD20 et les cellules Jurkat transgéniques ont été co-incubées avec un anticorps anti-CD20 dilué en série en présence de 1,8 mg/ml d'IVIG ou de 0,6 mg/ml de rhIgGl Fc. Les niveaux d'induction de l'ADCP ont été examinés en mesurant l'activité de la luciférase dans chaque groupe. Cependant, nous n'avons pas détecté d'effets inhibiteurs sur la réticulation de FcγRIIA médiée par l'anticorps anti-CD20 complexe immun dans les groupes de traitement 1, 8 mg / ml IVIG et 0, 6 mg / ml rhIgG1 Fc (Fig. 4c). Ce résultat est cohérent avec l'affinité relativement faible d'IVIG et de rhIgG1 Fc pour FcγRIIA par rapport à FcγRIIIA (tableau 3 et Fig. 4 supplémentaire).

Pour vérifier si rhIgG1 Fc bloque l'épuisement plaquettaire médié par les auto-anticorps, nous avons utilisé un modèle de souris ITP passif dans lequel les plaquettes sont épuisées par injection d'anticorps monoclonal de rat (MWReg30) reconnaissant l'intégrine murine spécifique des plaquettes αIIbβ348. Nous avons administré de l'IVIG ou du rhIgG1 Fc à la souris 2 h avant l'injection de l'anticorps antiplaquettaire MWReg30, puis analysé la numération plaquettaire après 4 h d'injection de MWReg30 (Fig. 5a). Lorsque l'IVIG a été administrée à 1 g/kg et 0,33 g/kg, elle a empêché la déplétion plaquettaire médiée par MWReg30 (Fig. 5b). De même, lorsque rhIgG1 Fc a été administré à 0,33 g/kg et 0,12 g/kg, soit le même rapport molaire que 1 g/kg et 0,33 g/kg IVIG, il a également empêché la déplétion plaquettaire (Fig. 5c). Cependant, lorsque l'IVIG a été administré à 0, 1 g / kg, cela n'a pas empêché la déplétion plaquettaire par MWReg30 (Fig. 5b). Contrairement à l'IVIG, lorsque le rhIgG1 Fc a été administré à 0,033 g/kg, soit le même rapport molaire que 0,1 g/kg d'IVIG, il a empêché la déplétion plaquettaire par MWReg30 (Fig. 5c). Ces résultats indiquent que rhIgG1 Fc bloque efficacement la déplétion plaquettaire médiée par le complexe immun MWReg30.

a Illustration schématique de l'expérience in vivo utilisant un modèle de souris ITP passif. Deux heures avant l'injection d'un anticorps antiplaquettaire MWReg30 (0,1 μg/g), les souris ont reçu une injection intrapéritonéale d'IVIG ou de rhIgG1 Fc. Quatre heures après l'injection de MWReg30, le sang a été extrait de la veine caudale et les plaquettes ont été colorées par le liquide de dilution Rees et Ecker et comptées au microscope à contraste de phase. b La numération plaquettaire résiduelle a été quantifiée 4 h après injection de MWReg30, lui-même injecté 2 h après IVIG (1 g/kg, 0,33 g/kg ou 0,12 g/kg). Chaque point représente des souris individuelles. (n = 4–7 des échantillons indépendants). c La numération plaquettaire résiduelle a été quantifiée 4 h après l'injection de MWReg30, qui a été administré 2 h après hIgG1 Fc (0,33 g/kg, 0,12 g/kg ou 0,033 g/kg). (n = 5-7 d'échantillons indépendants). d Parcelles représentatives de cytométrie en flux démontrant l'expansion de la population endogène CD4+/Foxp3+ Treg dans la rate. Les rates des groupes de traitement PBS, IVIG (1 g/kg), rhIgGl Fc (0,33 g/kg) ont été analysées. e Pourcentages de population Treg des rates des groupes de traitement PBS, IVIG (1 g/kg), rhIgG1 Fc (0,33 g/kg) après 6 h de traitement analysés par cytométrie en flux. Chaque point représente des souris individuelles. f L'ARN total a été isolé de la rate et utilisé pour la PCR quantitative en temps réel afin de mesurer les niveaux d'ARNm d'IL-4, d'IL-33 et de FcγRIIB. Les rates des groupes de traitement PBS, IVIG (1 g/kg), rhIgGl Fc (0,33 g/kg) ont été analysées. (n = 3 d'échantillons indépendants) Les différences entre les groupes ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle et un test t apparié. * P < 0,05, ** P < 0,01 et *** P < 0,001. Les barres d'erreur représentent l'écart type.

Étant donné que le Fc IgG1 α-2,6 sialylé dans les IVIG exerce une activité anti-inflammatoire en élargissant la population de cellules T régulatrices (Treg) et en favorisant l'expression de FcγRIIB via les cytokines TH2 IL-33 et IL-412,13, nous avons examiné si le rhIgG1 Fc récapituler l'activité anti-inflammatoire de l'α-2,6 sialylé IgG1 Fc en examinant la population de Treg et l'expression de l'IL-33, de l'IL-4 et du FcγRIIB dans la rate. Les résultats ont confirmé que la population de lymphocytes T régulateurs CD4 + / Foxp3 + avait tendance à augmenter après 6 h de traitement dans les groupes IVIG et rhIgG1 Fc, bien qu'elle n'atteigne pas la signification statistique (Fig. 5d, e). De plus, nous avons confirmé que l'expression de l'IL-33, de l'IL-4 et du FcγRIIB augmentait de manière significative dans les groupes de traitement IVIG et rhIgG1 Fc (Fig. 5f). Ces résultats montrent que le rhIgG1 Fc dérivé de poulet favorise l'expression des cytokines TH2 et du FcγRIIB, récapitulant ainsi avec succès les mécanismes de l'activité anti-inflammatoire médiée par le Fc IgG1 α-2,6 sialylé dans l'IVIG.

Ici, nous avons développé des poulets dont le génome a été modifié et qui produisent du rhIgG1 Fc dans le sérum et le jaune d'œuf. Nous montrons que les poulets ALB::hIgG1 Fc sécrètent le rhIgG1 Fc dans le sérum et le jaune d'œuf, et que le rhIgG1 Fc dérivé des poulets ALB::hIgG1 Fc est un agent anti-inflammatoire fonctionnel. En outre, nous avons suggéré que les poulets dont le génome a été modifié peuvent être utilisés comme une plate-forme efficace pour la production d'une alternative IVIG avec une activité anti-inflammatoire améliorée. En outre, nous avons suggéré que le ciblage des principaux gènes codant pour les protéines sériques exprimés principalement dans le foie de poulet est une approche efficace pour accumuler des produits biopharmaceutiques hautement galactosylés, α-2,6 sialylés et afucosylés dans le sérum et le jaune d'œuf.

Nous avons constaté que les poulets ALB::hIgG1 Fc présentaient une expression dominante des transcrits de hIgG1 Fc dans le foie, et que le schéma de N-glycosylation hébergé par hIgG1 Fc dérivé des poulets ALB::hIgG1 Fc présentait des niveaux élevés de α-2,6 sialylation et faibles niveaux de fucosylation. En particulier, les N-glycanes sialylés représentaient environ 30 % des N-glycanes totaux. Il s'agit d'un rapport de sialylation assez efficace étant donné que le hIgG1 Fc est à peine une protéine sialylée en raison de sa structure49. En général, l'IgG1 humaine produite à partir du système d'expression de mammifère a à peine sialylé le Fc, et l'IgG1 humaine naturelle du plasma humain a un faible taux de sialylation (environ 10 % du total des N-glycanes)26,27. En outre, les IgG humaines produites à partir de systèmes d'expression de mammifères, ainsi que les IgGl humaines naturelles à partir de plasma, contiennent des niveaux élevés de noyau Fc26,27 fucosylé. Par conséquent, les poulets ALB::hIgG1 Fc constituent un système unique pour la production de hIgG1 Fc avec d'abondantes sialylations terminales et de faibles niveaux de fucosylation. De plus, nous avons confirmé que les résidus terminaux d'acide sialique de rhIgG1 Fc dérivés de poulets ALB :: hIgG1 Fc sont principalement liés en α-2,6, ce qui est essentiel pour l'induction de l'activité anti-inflammatoire11. Par conséquent, un bioréacteur de poulet est une plate-forme efficace pour produire hIgG1 Fc hébergeant des N-glycanes bénéfiques pour induire une activité anti-inflammatoire.

Notre analyse du schéma de N-glycosylation a détecté des N-glycanes mineurs, initialement non identifiés dans le sérum, dans le rhIgG1 Fc dérivé du jaune d'œuf. Ce résultat est cohérent avec celui d'un rapport précédent montrant que plusieurs N-glycanes, qui n'étaient pas identifiés dans les IgY sériques, ont été détectés dans les IgY jaunes ; il semble donc que des modifications mineures des N-glycanes soient effectuées lors du transport des protéines du sérum au jaune d'œuf50. De plus, nous n'avons pas détecté de protéine de fusion ALB-Fc dans le jaune d'œuf (bien qu'elle ait été initialement détectée dans le sérum), ce qui suggère que la protéine de fusion ALB-Fc non transformée n'a pas été transférée au jaune d'œuf, ou que le clivage de Fc du partenaire de fusion s'est produit pendant le processus de transport, comme indiqué précédemment33.

Lorsque nous avons analysé l'affinité de rhIgG1 Fc pour les FcγR humains, nous avons constaté que rhIgG1 Fc avait une affinité significativement plus élevée pour FcγRIIIA en raison de faibles niveaux de fucosylation. Par conséquent, rhIgG1 Fc a inhibé la réticulation de FcγRIIIA médiée par des complexes immuns plus puissamment que les IVIG commerciales. Ces résultats indiquent que rhIgG1 Fc bloque efficacement FcγRIIIA de manière monovalente. Ceci est important car le blocage multivalent de FcγRIIIA par des anticorps monoclonaux induit des effets secondaires indésirables médiés par la réticulation de FcγRIIIA, bien qu'il récapitule puissamment l'activité anti-inflammatoire de l'IVIG et ait montré une efficacité dans l'ITP réfractaire. Une étude récente a rapporté que le blocage monovalent du FcγRIIIA par un fragment Fab contourne la toxicité médiée par la réticulation du FcγRIIIA47. Dans cette optique, le Fc hIgG1 faiblement fucosylé dérivé de poulets ALB :: hIgG1 Fc a bloqué de manière monovalente le FcγRIIIA avec une affinité plus élevée que l'IVIG humaine et a induit une réponse anti-inflammatoire sans toxicité associée. Par conséquent, le système de bioréacteur de poulet peut être une plate-forme de production optimale pour hIgG1 Fc avec un blocage amélioré de FcγRIIIA et une activité anti-inflammatoire ultérieure en raison d'une faible fucosylation.

Nous nous attendons également à ce que rhIgG1 Fc ait une affinité plus élevée pour DC-SIGN car ce dernier a été suggéré comme récepteur pour reconnaître le Fc52 α-2,6 sialylé. Malheureusement, dans notre contexte d'analyse SPR, l'affinité de l'IVIG et du rhIgG1 Fc avec le DC-SIGN humain n'a pas pu être mesurée. Ces résultats sont conformes à un rapport récent montrant que le DC-SIGN humain a montré une affinité de liaison négligeable pour le Fc α-2,6 sialylé en cytométrie en flux et en analyse SPR53. D'autres méthodes telles que les ELISA à base de cellules peuvent être nécessaires pour mesurer l'affinité entre le Fc sialylé et le DC-SIGN.

Pour confirmer que le rhIgG1 Fc dérivé de poulets dont le génome a été modifié a également une activité anti-inflammatoire in vivo, nous avons administré le rhIgG1 Fc à un modèle de souris ITP passif. Nous avons constaté que le rhIgG1 Fc dérivé de poulets dont le génome a été modifié exerce une activité anti-inflammatoire chez ces souris, même à des doses plus faibles. Étant donné que des rapports antérieurs ont montré que l'amélioration de la sialylation α-2,6 dans la région Fc augmentait de manière significative l'activité anti-inflammatoire des IVIG, l'activité anti-inflammatoire accrue de rhIgG1 Fc dérivée de poulets dont le génome a été modifié pourrait être due à une augmentation de la sialylation α-2,6 de Fc que les IgIV dérivées du plasma10,11,12,54. De plus, le Fc rhIgG1 faiblement fucosylé peut également affecter l'activité anti-inflammatoire améliorée du Fc rhIgG1 et ce résultat est conforme à une étude récente montrant que les IgG non fucosylés et galactosylés ont une activité anti-inflammatoire améliorée in vivo55.

Dans notre étude, les IVIG et le rhIgG1 Fc ont tendance à élargir la population de Treg et à favoriser l'expression de l'IL-33, de l'IL-4 et du FcγRIIB, ce qui suggère que le hIgG1 Fc dérivé des poulets ALB :: hIgG1 Fc récapitule avec succès l'anti-inflammatoire activité de l'IgG1 Fc α-2,6 sialylé dans l'IgIV. Sur la base de ces résultats, nous avons suggéré ici que les poulets ALB :: hIgG1 Fc ont le potentiel d'être l'une des sources d'approvisionnement d'IgIV alternatives et résoudront les limitations de la thérapie IVIG liées aux pénuries d'approvisionnement. De plus, nous avons proposé que les caractéristiques de N-glycosylation des protéines recombinantes dérivées de poulets ALB::hIgG1 Fc sont optimales pour la production de produits sanguins dérivés du foie humain tels que les facteurs de coagulation sanguine, car les facteurs sanguins humains ont également un profil de N-glycosylation comprenant formes α-2,6 sialylées et faiblement fucosylées, identiques à celles des protéines dérivées du foie de poulet56. Enfin, les poulets ne produisent pas de glycanes non humains ; ainsi, les poulets dont le génome a été modifié peuvent constituer une plate-forme optimale pour la production de produits sanguins humains recombinants humanisés. Sinon, les glycoformes hautement galactosylées, sialylées et faiblement fucosylées produites dans le jaune d'œuf peuvent entraîner des anticorps monoclonaux avec non seulement des fonctions effectrices Fc améliorées (telles que l'activité CDC et ADCC), mais également une demi-vie sérique accrue57.

En conclusion, nous avons démontré ici que le système de bioréacteur de poulet qui ciblait le gène majeur de la protéine sérique accumule efficacement hIgG1 Fc dans le sérum et le jaune d'œuf et cette approche a le potentiel d'être largement appliquée pour produire divers produits biopharmaceutiques avec une efficacité accrue via un schéma de N-glycosylation optimal.

La gestion et l'utilisation expérimentale des poulets et des souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université nationale de Séoul (SNU-190401-1-2 et SNU-210726-1-1). Les animaux de laboratoire ont été soignés selon un programme de gestion standard à la ferme animale universitaire et à l'institut des ressources animales de laboratoire de l'université nationale de Séoul.

Le vecteur CRISPR/Cas9 ciblant l'intron 13 du gène ALB de poulet a été construit à l'aide du vecteur PX459 (plasmide Addgene #62988). Pour insérer des séquences d'ARN guide (ARNg) dans le plasmide CRISPR/Cas9, des oligonucléotides sens et antisens ont été conçus et synthétisés (Bioneer, Daejeon, Corée). Ces oligonucléotides ont été recuits dans les conditions de thermocyclage suivantes : 30 s à 95°C, 2 min à 72°C, 2 min à 37°C et 2 min à 25°C. Pour le marquage ciblé du hIgG1 Fc à l'extrémité 3 'du gène ALB, le plasmide donneur contenant l'intron 13 et l'exon 14 du gène ALB et T2A, suivi de la séquence codante hIgG1 Fc et du site de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine a été synthétisé dans le pBHA dorsale vectorielle (Bioneer, Daejeon, Corée). Les oligonucléotides utilisés pour la construction du vecteur CRISPR/Cas9 ont été répertoriés dans le tableau supplémentaire 3.

Pour l'établissement de la lignée PGC, les PGC mâles White Leghorn (WL) ont été maintenus et sous-passés sur du DMEM knock-out (Invitrogen, Carlsbad, CA) additionné de 20 % de FBS (Invitrogen), 2 % de sérum de poulet (Sigma-Aldrich, St.Louis , MO), 1 × nucléosides (Millipore, Temecula, CA), 2 mM de l-glutamine, 1 × acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, 10 mM de pyruvate de sodium, 1 × antibiotique-antimycotique (Invitrogen) et croissance basique des fibroblastes humains facteur (10 ng/ml ; Sigma-Aldrich). Les PGC de poulet ont été cultivées dans un incubateur à 37 ° C sous une atmosphère de 5% de CO2 et de 60 à 70% d'humidité relative. Les PGC ont été sous-cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris inactivés à la mitomycine à des intervalles de 5 à 6 jours via un pipetage doux. Pour l'édition du génome dans les PGC de poulet, des plasmides CRISPR/Cas9 (3 µg) et des plasmides donneurs (3 µg) ont été co-introduits dans 1 × 105 PGC cultivées avec 6 µl de réactif Lipofectamine 2000 en suspension dans 1 ml d'OptiMEM. Puis, 4 h après la transfection, le mélange de transfection a été remplacé par du milieu de culture PGC. De la puromycine (1 ug/ml) a été ajoutée au milieu de culture 1 jour après la transfection. Après 2 jours de traitement à la puromycine, des PGC sélectionnées ont été lavées et remplacées par du milieu de culture PGC frais et développées pendant 4 à 6 semaines. L'insertion ciblée du plasmide donneur a été confirmée par analyse PCR de l'ADN génomique. Les amorces utilisées dans cette étude ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire 3.

Pour produire des poulets à génome modifié, une fenêtre a été découpée à l'extrémité pointue de l'œuf receveur coréen Ogye (KO), et plus de 3000 PGC WL modifiés par génome ont été transplantés dans l'aorte dorsale des stades 14 à 17 de Hamburger et Hamilton. embryons receveurs . La fenêtre des œufs a été scellée avec un film de paraffine et les œufs ont été incubés avec l'extrémité pointue vers le bas jusqu'à l'éclosion. Les poussins éclos ont été élevés dans la ferme d'élevage institutionnelle. Après maturation sexuelle, les coqs receveurs ont été accouplés avec des poules femelles WT. La progéniture modifiée par le génome a été identifiée sur la base de la couleur des plumes de la progéniture et de l'analyse et du séquençage de l'ADN génomique ultérieurs.

Pour quantifier le rhIgG1 Fc dans le sérum, du sang total de poulet ALB+/hIgG1 Fc et ALBhIgG1 Fc/hIgG1 Fc a été prélevé et une solution d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,5 M a été ajoutée au sang prélevé pour empêcher la coagulation du sang. Les échantillons de sang collectés ont été centrifugés à 2000 rpm, 10 min, 4 ° C et les surnageants ont été collectés et utilisés pour l'analyse ELISA. Pour quantifier le rhIgG1 Fc dans le jaune d'œuf, les œufs pondus de quatre poulets G2 ALB+/hIgG1 Fc ont été collectés et les jaunes d'œufs ont été séparés des blancs d'œufs. Les échantillons de sérum et de jaune collectés ont été dilués dans du DW et quantifiés par ELISA à l'aide d'un kit ELISA IgG humain (ab100547, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), conformément aux instructions du fabricant. Les concentrations mesurées ont été divisées en trois pour ajuster le poids moléculaire de l'IgG standard à rhIgGl Fc.

Pour la purification d'IgG1 Fc humaine à partir de sérum de poulet transgénique, du sulfate d'ammonium 4 M a été ajouté lentement au sérum de poulet. Le mélange a été agité pendant une nuit à 4°C, puis centrifugé pendant 30 min à 4°C à 10 000 g. Le culot a été remis en suspension dans un volume égal de 1 x PBS au volume de sérum d'origine. Ensuite, le mélange a été dialysé contre un tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 7,2). L'échantillon a été chargé sur une colonne de protéine A (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suède) et la protéine a été éluée avec un gradient de 100 ml d'acide citrique 100 mM (pH 2,8). La protéine a ensuite été purifiée et fractionnée par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) à l'aide d'une colonne HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare Bio-Sciences) pré-équilibrée avec du Tris-HCl 20 mM, du NaCl 175 mM (pH 7,4). Pour la purification d'IgG1 Fc humaine à partir de jaune d'œuf, le jaune d'œuf a été séparé et dilué avec 9 volumes d'eau distillée. L'échantillon a été congelé à -20 °C pendant une nuit et décongelé à température ambiante. Après décongélation, le liquide surnageant a été récupéré et filtré. Ensuite, l'échantillon a été chargé sur une colonne de protéine A (GE Healthcare Bio-Sciences) et la protéine a été éluée avec un gradient de 100 ml d'acide citrique 100 mM (pH 2,8).

Pour le Western blot de rhIgG1 Fc dans le sérum et le jaune, le sérum de poulet ALB+/hIgG1 Fc a été dilué dans de l'eau distillée (DW) et le jaune d'oeuf de poulet ALB+/hIgG1 Fc a été prétraité par la méthode de congélation et de décongélation comme décrit dans Purification of Human IgG1 Fc de la section sérum et jaune d'œuf. Le sérum de poulet de type sauvage a été utilisé comme contrôle. L'échantillon préparé a été soumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10 %, transféré sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (Millipore, Billerica, MA). Après le transfert, la membrane de fluorure de polyvinylidène a été bloquée avec du lait écrémé à 3 % pendant 1 h à température ambiante (BD Biosciences, San Jose, CA). La membrane bloquée a été incubée avec un anticorps primaire anti-IgG humaine de chèvre (10319, Alpha diagnostic, San Antonio, TX) à 4 ° C pendant la nuit. L'anticorps primaire a été lavé trois fois avec du tampon PBST à 0,1 % et la membrane a été incubée avec un anticorps secondaire IgG d'âne anti-chèvre conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (sc-2020, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) pendant 1 h à température ambiante. Après lavage de l'anticorps secondaire, l'activité enzymatique HRP a été détectée en ajoutant un substrat de transfert Western ECL (GE Healthcare Bio-Sciences).

L'analyse des N-glycanes de rhIgGl Fc dérivé de poulet ALB :: hIgG1 Fc a été réalisée par UPLC/MS-MS. En bref, le rhIgG1 Fc purifié a été incubé avec la PNGase F pendant 16 h à 37 °C. Le rhIgGl Fc déglycosyté a été précipité à l'aide d'éthanol et centrifugé à 10 000 g pendant 10 min. Le surnageant contenant le N-glycane libéré a été transféré dans un nouveau tube et complètement séché à l'aide du concentrateur Speed-Vac. L'échantillon séché a été marqué avec du procaïnamide pour l'analyse de fluorescence. L'échantillon de N-glycane marqué a été analysé et quantifié par UPLC/MS-MS. Une colonne ACQUITY UPLC BEH Glycan (1,2 × 150 mm, 1,7 μm ; Waters, New Castle, DE) avec un détecteur de fluorescence (Waters iClass UPLC) a été utilisée pour la séparation et la détection des N-glycanes. Les conditions LC étaient les suivantes : débit (0,5 mL/min), température de la colonne (60 °C), tampon de phase mobile A (formiate d'ammonium 100 mM, pH 4,5), tampon B (100 % acétonitrile), volume d'injection (8 mL), gradient linéaire (75 à 60 % B pendant 46,5 min, 60 à 0 % B pendant 1,5 min, 0 % B pendant 1 min, 0 à 75 % B pendant 1 min et 75 % B pendant 13 min). Une spectrométrie de masse à haute résolution, triple TOF MS (AB SCIEX, Concord, Ontario, Canada), a été utilisée pour l'identification des N-glycanes. La distribution des N-glycanes a été analysée avec Empower (Waters).

Le Fc rhIgG1 purifié et l'EPO recombinante dérivée de cellules CHO (n° de catalogue 100-64, Peprotech) ont été incubés dans un tampon de dénaturation des glycoprotéines (New England Biolabs, Ipswich, MA, États-Unis) à 100 ° C pendant 10 min. Ensuite, l'échantillon a été clivé en ajoutant de la PNGase F (New England Biolabs) selon les protocoles du fabricant. Le rhIgGl Fc purifié et déglycosylé a été soumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10 % et transféré sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (Millipore) pour un transfert de lectine. La membrane a été bloquée avec de l'albumine de sérum bovin à 3 % (Sigma-Aldrich) dans une solution saline tamponnée au Tris (Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,5 ; TBS) à 4 °C pendant une nuit. Par la suite, la membrane a été incubée avec 1,0 μg/ml de lectines biotinées SNA/EBL (spécifiques de ɑ2,6-SA ; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) et MAL II (spécifiques de ɑ2,3 SA ; Vector Laboratories) dans du TBST ( TBS contenant 0,05 % de Tween 20) pendant 1 h. Après deux lavages avec du tampon TBST, les membranes ont été incubées avec de l'avidine conjuguée à la peroxydase de raifort (kit VECTASTAIN ABC ; Vector Laboratories) pendant 1 h. La membrane a été lavée avec du tampon TBST et la coloration a été réalisée avec les réactifs de détection ECL Western blot (GE Healthcare Bio-Sciences).

Pour l'analyse SPR, les IVIG ont été achetées auprès de GC pharma, Yong-in, Corée. Les FcγR humains ont été achetés auprès de Sino Biological Inc, Pékin, Chine (FcγRIA-10256-H08H; FcγRIIA 167 Arg-10374-H08H; FcγRIIIA F176V-10389-H08H1; FcRn-CT009-H08H; DC-SIGN-10200-H01H). rhIgG1 Fc a été purifié à partir de sérum de poulet juvénile ALB :: hIgG1 Fc. L'analyse SPR a été réalisée à l'aide de Biacore T200 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Les FcγR ont été immobilisés sur une puce de capteur CM5 (BR-1005-30, GE Healthcare). IVIG et rhIgG1 Fc ont été injectés dans la puce de capteur revêtue de FcγRs. Les dosages cinétiques ont été effectués par dilution en série de trois fois pour FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA, DC-SIGN et dilution en série de deux fois pour FcRn. Pour FcγRIA et DC-SIGN, la dilution a commencé à partir de 300 nM. Pour le FcγRIIA, la dilution a commencé à partir de 20 μM. Pour FcγRIIIA, la dilution a commencé à partir de 3 μM d'IVIG et 300 nM de hIgG1 Fc. Pour le FcRn, la dilution a commencé à partir de 500 nM d'IVIG et 250 nM de rhIgG1 Fc. La régénération a été réalisée par injection de 10 mM de glycine pour FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA, DC-SIGN et 100 mM de Tris-HCl pour FcRn. La constante de dissociation (KD) pour la liaison monomérique de l'IVIG et du rhIgG1 Fc aux FcγR a été calculée par un modèle cinétique à cycle unique pour FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIIA et un modèle cinétique multicycle pour FcRn, DC-SIGN.

Les tests ADCC ont été effectués à l'aide d'un kit complet ADCC Reporter Bioassay (G7014, Promega, Madison, WI, USA) conformément au protocole du fabricant. En bref, des cellules WIL2-S positives pour CD20 ont été remises en suspension dans du RPMI 1640 et du sérum humain à faible teneur en IgG et ensemencées à 10 000 cellules par puits dans une plaque de culture opaque à 96 puits contenant des cellules effectrices Jurkat T exprimant FcγRIIIA génétiquement modifiées. Ces lymphocytes T Jurkat génétiquement modifiés possèdent également un gène rapporteur de la luciférase dont l'expression est pilotée par l'élément de réponse NFAT. Ensuite, des IVIG (GC pharma) ou rhIgG Fc et des anticorps anti-CD20 dilués en série ont été ajoutés et incubés pendant 6 h à 37 °C, 5 % de CO2. La réticulation de FcγRIIIA et l'activation de la signalisation NFAT ont été déterminées à l'aide du test Bio-Glo Luciférase, et des mesures ont été prises sur un lecteur de microplaques.

Les tests ADCP ont été effectués à l'aide du kit complet ADCP Reporter Bioassay (G9901, Promega) conformément au protocole du fabricant. En bref, des cellules Raji CD20-positives ont été remises en suspension dans du RPMI 1640 et du sérum humain à faible teneur en IgG et ensemencées à 10 000 cellules par puits dans une plaque de culture opaque à 96 puits contenant des cellules FcγRIIA génétiquement modifiées exprimant des lymphocytes Jurkat T effecteurs. Ces lymphocytes T Jurkat génétiquement modifiés possèdent également un gène rapporteur de la luciférase dont l'expression est pilotée par l'élément de réponse NFAT. Ensuite, des IVIG ou rhIgG Fc et des anticorps anti-CD20 dilués en série ont été ajoutés et incubés pendant 6 h à 37 ° C, 5 % de CO2. La réticulation de FcγRIIA et l'activation de la signalisation NFAT ont été déterminées à l'aide du test Bio-Glo Luciférase, et des mesures ont été prises sur un lecteur de microplaques.

8 semaines de souris femelles C57BL/6 ont été utilisées dans une expérience in vivo. Avant de commencer l'expérience, des échantillons de sang de chaque souris ont été prélevés dans la veine caudale. Les plaquettes ont été colorées avec une solution de bleu de crésyle brillant à 1 % et les numérations plaquettaires ont été calculées au microscope optique (numération PLT 0 h). Après cela, des doses de 1 g/kg, 0,33 g/kg et 0,12 g/kg d'IVIG (GC pharma) et des doses de 0,33 g/kg, 0,12 g/kg et 0,033 g/kg de rhIgG1 Fc ont été injectées par voie intrapéritonéale (ip). cavité. Après 2 h d'injection d'IVIG et de rhIgG1 Fc, l'anticorps antiplaquettaire MWReg30 (0, 1 μg / g) a été injecté dans la cavité ip. Après 4 h de MWReg30, le sang a été extrait de la veine caudale et la coloration des plaquettes a été réalisée à l'aide d'une solution de bleu de crésyle brillant à 1 %, et le nombre de plaquettes a été calculé au microscope optique (4 h PLT counts). Le pourcentage de numération plaquettaire résiduelle a été calculé en divisant le nombre de PLT à 4 h par le nombre de PLT à 0 h.

La rate de chaque souris a été prélevée 6 h après l'injection de PBS, IVIG (1 g/kg) et rhIgGl Fc (0,33 g/kg). Les cellules spléniques ont été colorées à l'aide d'un kit de détection Treg de souris (130-120-674, Miltenyi Biotic, Bergisch Gladbach, Allemagne). Les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-CD25 de souris marqué par APC et un anticorps CD4 marqué par Vio-Blue pendant 30 min sous réfrigération. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, perméabilisées et fixées à l'aide d'une solution de fixation/perméabilisation pendant 30 min dans l'obscurité sous réfrigération. Après deux lavages, les cellules ont été traitées avec un anticorps Foxp3 anti-souris marqué au PE pendant 30 min dans l'obscurité sous réfrigération. Les cellules colorées ont été passées sur un cytomètre en flux (BD Biosciences, San Jose, CA) et les données ont été analysées à l'aide d'un logiciel FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

La rate de chaque souris a été prélevée 6 h après l'injection de PBS, IVIG (1 g/kg) et rhIgGl Fc (0,33 g/kg). L'ARN total a été extrait d'échantillons de rate à l'aide du réactif TRIzol (Molecular Research Center, États-Unis) conformément au protocole du fabricant et l'ADNc a été synthétisé à l'aide du système de synthèse Superscript III First-Strand (Invitrogen). Le mélange PCR contenait 2 μL de tampon PCR, 1 μL de colorant qPCR EvaGreen 20 × (Biotium, Hayward, CA, États-Unis), 0,4 μL de mélange dNTP à 10 mmol/L et 10 pmol de chacune des amorces sens et antisens spécifiques au gène. (Tableau supplémentaire 3). La RT-qPCR a été réalisée en triple. L'expression relative du gène cible a été quantifiée après normalisation par rapport à l'expression de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) de souris en tant que contrôle endogène.

Pour l'analyse de la demi-vie, le Fc rhIgG1 purifié à partir de jaune d'œuf et le Fc recombinant dérivé de la cellule HEK293 (10702-HNAH, Sino Biological Inc) ont été injectés par voie ip à 8 semaines de souris femelles C57BL/6 à une dose de 100 μg/souris. Après 24 h d'injection, le sang a été prélevé par la veine caudale pendant 5 jours et le sérum a été obtenu par centrifugation. La concentration sérique de rhIgGl Fc purifié à partir de jaune d'œuf et de Fc recombinant dérivé de la cellule HEK293 a été déterminée par ELISA en utilisant un kit ELISA IgG humain (Abcam). La demi-vie a été calculée par analyse de régression non linéaire.

Chaque expérience a été réalisée avec au moins trois échantillons et animaux biologiquement indépendants pour la reproductibilité et l'analyse statistique a été réalisée à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Des différences significatives entre plus de deux groupes ont été déterminées par une analyse de variance ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Bonferroni. L'analyse statistique entre deux groupes a été analysée par un test t apparié. Les données ont été présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart type. Une valeur de P < 0,05 indique une signification statistique.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude actuelle peuvent être trouvés dans les figures, les tableaux et les informations supplémentaires. Les données sources utilisées pour générer des graphiques dans le texte principal sont disponibles dans les données supplémentaires 1. L'image de gel non traitée peut être trouvée dans la Fig. 5 supplémentaire. Toutes les autres données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) [NRF-2015R1A3A2033826].

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jin Se Park, Hee Jung Choi.

Département de biotechnologie agricole et Institut de recherche sur l'agriculture et les sciences de la vie, Université nationale de Séoul, Séoul, République de Corée

Jin Se Park, Hee Jung Choi, Kyung Min Jung, Kyung Youn Lee, Ji Hyeon Shim, Kyung Je Park, Young Min Kim et Jae Yong Han

Avinnogen Co., Ltd, 1 Gwanak-ro, Gwanak-gu, Séoul, République de Corée

Parc Jin Se et Young Min Kim

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JYH a participé à la conception de l'étude et à la coordination générale ; JSP a participé à la conception de l'étude et a réalisé les expériences, l'interprétation des données et a rédigé la première ébauche du manuscrit ; HJC a réalisé les expériences, l'interprétation des données et a rédigé la première ébauche du manuscrit. KMJ, KYL et JHS ont mené des expériences. KJP a effectué une gestion expérimentale des animaux. YMK et JYH ont effectué l'interprétation des données et participé à la rédaction de la version finale du manuscrit.

Correspondance à Jae Yong Han.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la gestion principale : Eve Rogers et Anam Akhtar. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Park, JS, Choi, HJ, Jung, KM et al. Production d'IgG1 Fc humain recombinant avec un schéma de N-glycosylation bénéfique pour l'activité anti-inflammatoire à l'aide de poulets modifiés en génome. Commun Biol 6, 589 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04937-5

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Reçu : 28 avril 2022

Accepté : 12 mai 2023

Publié: 01 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04937-5

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