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Communications Biology volume 6, Article number: 583 (2023) Citer cet article

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La capacité d'imager la chimie cellulaire à l'échelle nanométrique est essentielle pour comprendre la biologie cellulaire, mais de nombreuses microscopies optiques sont limitées par la limite de diffraction d'environ (200–250) nm. La microscopie électronique et les techniques de fluorescence à super résolution dépassent cette limite, mais s'appuient sur la coloration et l'étiquetage spécialisé pour générer un contraste d'image. Il est donc difficile d'obtenir des informations sur la chimie fonctionnelle des composants intracellulaires. Ici, nous démontrons une technique de cartographie chimique intracellulaire sans étiquette avec une résolution à l'échelle nanométrique (~ 30 nm). Nous utilisons un microscope optique à sonde éclairé par un laser infrarouge moyen dont les longueurs d'onde excitent les modes vibrationnels des groupes fonctionnels présents dans les molécules biologiques. À titre de démonstration, nous cartographions chimiquement les structures intracellulaires dans les cellules humaines de myélome multiple et comparons les morphologies avec des micrographies électroniques de la même lignée cellulaire. Nous démontrons également une cartographie sans étiquette à des longueurs d'onde choisies pour cibler les signatures chimiques des protéines et des acides nucléiques, d'une manière qui peut être utilisée pour identifier des marqueurs biochimiques dans l'étude de la maladie et de la pharmacologie.

La voie standard vers la connaissance ultrastructurale, la microscopie électronique (EM), utilise des échantillons colorés avec des métaux lourds pour générer un contraste d'absorption d'électrons et une conductivité électrique. Ils sont généralement noyés dans de la résine pour résister au bombardement électronique sous vide dans un processus qui prend plusieurs jours. De plus, en l'absence d'immunomarquage très spécifique, les images EM ne fournissent que des informations morphologiques et ne révèlent que les caractéristiques d'ultrastructure qui prennent la tache.

Une variété de microscopies à fluorescence à super-résolution permettent également l'imagerie de sous-diffraction des structures cellulaires1,2, mais toutes nécessitent des étiquettes spécifiques au problème à résoudre et reposent souvent sur une connaissance a priori des structures pour un étiquetage efficace. En pratique, le photoblanchiment des fluorophores, ainsi que les problèmes de stabilité et de spécificité, limitent la précision avec laquelle les marqueurs peuvent être localisés. Même si ces défis techniques sont surmontés, la capacité à localiser les structures est limitée par la distance entre la structure cible et le fluorophore, définie par les longueurs des marqueurs fluorescents et des molécules de liaison utilisées, qui sont généralement de plusieurs nanomètres chacune3. Surtout, il existe également un risque que le marquage perturbe la biologie des échantillons1.

La spectroscopie et l'imagerie infrarouges (IR) sont largement utilisées pour obtenir des informations chimiques quantitatives sans étiquette, mais la limite de diffraction le rend généralement incapable d'imagerie au niveau intracellulaire. Pour dépasser cette limite, plusieurs techniques d'imagerie basées sur des sondes ont été développées qui combinent le pouvoir de résolution à l'échelle nanométrique de la microscopie à force atomique (AFM) avec la sensibilité chimique de la spectroscopie IR4,5. Nous utilisons la microscopie optique en champ proche à balayage de type diffusion (s-SNOM), où la sonde AFM est éclairée par un laser IR accordable. La collecte et l'analyse de la lumière IR rétrodiffusée à partir de la petite région où la pointe et l'échantillon interagissent nous permettent de déduire les propriétés d'absorption IR du matériau de l'échantillon dans cette région. Le réglage du laser nous permet d'imager avec une spécificité chimique sans avoir besoin de coloration ou d'étiquetage. Surtout, nous imaginons le matériel biologique lui-même. Nous détectons des caractéristiques ultrastructurales qui n'ont jamais été imagées directement avec la lumière, ce qui soulève la possibilité de trouver de nouvelles structures intracellulaires qui n'apparaissent pas dans EM.

s-SNOM a déjà été utilisé pour l'imagerie d'échantillons biologiques isolés tels que des complexes protéiques6,7,8, des virus9 et des fibrilles amyloïdes10, ainsi que pour l'imagerie de surface de cellules entières11,12,13. Les structures intracellulaires dans les cellules et les tissus ont également été imagées dans des organismes unicellulaires14 et des tissus rétiniens de poisson zèbre15, respectivement. Ici, nous nous appuyons sur cela en cartographiant chimiquement les structures intracellulaires dans les cellules humaines de myélome multiple, y compris, à la connaissance des auteurs, les premières images directement optiques de sous-diffraction du réticulum endoplasmique (ER), des mitochondries (Mt) et des composants fibrillaires dans les nucléoles. En faisant varier la longueur d'onde d'éclairage pour cibler différents groupes chimiques dans les cellules, nous démontrons également l'isolement de l'ultrastructure d'une manière qui n'est traditionnellement obtenue qu'avec un étiquetage très spécifique.

Dans notre configuration s-SNOM (Fig. 1), un laser à cascade quantique à IR moyen (QCL) illumine une sonde conductrice pointue qui, en raison de ce que l'on appelle l'effet paratonnerre, établit un champ optique amélioré et très localisé à son extrémité16 ,17. La présence de l'échantillon modifie ce champ de sorte que les propriétés d'absorption IR locales de l'échantillon peuvent être récupérées à partir de la lumière rétrodiffusée18. En particulier, pour les oscillateurs faibles tels que les modes vibrationnels sondés ici, la phase de la lumière rétrodiffusée est proportionnelle au terme d'atténuation de l'indice de réfraction complexe et est donc également proportionnelle au coefficient d'absorption en champ lointain à la longueur d'onde d'imagerie particulière19. Fondamentalement, la résolution spatiale des images est déterminée par la taille de la pointe de sonde, et non par la longueur d'onde de la lumière16,20, ce qui nous permet de battre la diffraction de généralement deux ordres de grandeur pour notre longueur d'onde d'imagerie de \(\sim\)6 µm .

La lumière infrarouge (IR) du laser à cascade quantique (QCL) est divisée en deux bras avec un séparateur de faisceau (BS). Un bras est focalisé avec un miroir parabolique (PM) sur une sonde métallique pointue oscillant à la fréquence Ω au-dessus d'un échantillon. L'autre bras est modulé en phase à la fréquence M par un miroir vibrant (VM) et sert de faisceau de référence. La lumière rétrodiffusée de la sonde et du faisceau de référence est détectée avec un détecteur au tellurure de mercure et de cadmium (MCT) tandis que l'échantillon est balayé par trame sur une platine piézoélectrique. Les propriétés optiques de l'échantillon sont récupérées à partir de la lumière rétrodiffusée.

Ici, nous choisissons d'appliquer la technologie aux cellules de myélome multiple car elles sont un exemple d'une maladie humaine importante où les mécanismes pathologiques cruciaux se produisent au niveau des cellules individuelles21, ce qui les rend particulièrement adaptées à notre approche. Ils sont également bien étudiés avec la transmission EM (TEM)22,23. Les cellules sont fixées, incorporées dans de la résine époxy et sectionnées à (70–200) nm mais laissées non osmiques pour permettre une imagerie sans étiquette. Les sections utilisées pour l'imagerie s-SNOM sont placées sur un substrat de silicium dont la réflectivité amplifie le signal et améliore la qualité de l'image24. Des détails sur le choix de l'épaisseur de section et l'effet d'un substrat réfléchissant sont fournis dans les notes supplémentaires 1 et 2, respectivement. Des sections de cellules supplémentaires sont post-colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb et imagées avec TEM afin de comparer les images s-SNOM.

Un schéma de détection pseudo-hétérodyne25 est essentiel à la technique. Le signal mesuré au niveau du détecteur est analysé aux harmoniques de la fréquence d'oscillation de la sonde, Ω, qui sont divisées en bandes latérales séparées par la fréquence de modulation de phase, M, du miroir de référence vibrant. Pour les images présentées dans cet article, la troisième harmonique de la fréquence d'oscillation de la sonde est utilisée. Cela donne une mesure de phase hautement sensible à la surface et sans arrière-plan, \({\phi }_{3}\). La troisième harmonique est choisie car les harmoniques inférieures sont généralement contaminées par un signal de fond, tandis que les harmoniques supérieures présentent un rapport signal sur bruit inférieur. Un ensemble d'images collectées à chaque harmonique disponible, n, est fourni dans la Fig. 1 supplémentaire pour être complet. En plus des mesures de phase, le système s-SNOM récupère également des mesures d'amplitude optique et de topographie d'échantillon. Des cartes représentatives de ces quantités et une explication des informations qu'elles contiennent sont fournies dans la Fig. 2 supplémentaire.

La figure 2a est une image s-SNOM d'une cellule de myélome acquise à 1667 cm-1, une longueur d'onde qui excite les modes vibrationnels dans les fragments amide présents dans les protéines et les nucléobases. Le déphasage mesuré, \({\phi }_{3}\), est proportionnel à l'absorption de l'échantillon et, par conséquent, à cette longueur d'onde, à la densité d'amide. Les caractéristiques morphologiques de la carte chimique résultante permettent l'identification de plusieurs structures intracellulaires, y compris un noyau multilobé délimité par une membrane nucléaire (NM) et contenant un nucléole (Nuc). Des caractéristiques ultrastructurales similaires sont observées dans l'image TEM d'une cellule de myélome (Fig. 2b), soutenant l'identification des structures.

une cartographie chimique s-SNOM des cellules myélomateuses acquises à 1667 cm-1, ciblant les groupes amides dans les protéines et les nucléobases. Les encarts a(i) et a(ii) sont des images s-SNOM à plus haute résolution. b, c TEM de cellules de myélome post-colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb mais laissées non osmiques. Les encarts c(i) et c(ii) montrent les structures plus en détail. d Profil spatial du signal s-SNOM le long de la ligne rouge en a(ii). Membrane nucléaire NM, nucléole Nuc, réticulum endoplasmique ER, mitochondries Mt. Barres d'échelle 2 µm (a, b), 1 µm (c) et 500 nm (a(i), a(ii), c(i), c(ii)).

Le niveau le plus élevé d'absorption d'amide se produit dans le nucléole. C'est le site de la biogenèse des ribosomes, qui repose sur de nombreuses protéines, dont la fibrillarine, la nucléoline et la nucléophosmine26,27,28. La membrane nucléaire est également riche en protéines29 et présente donc une forte absorption d'amide dans la cartographie chimique. Le motif granulaire à l'intérieur de l'enveloppe nucléaire est la chromatine, constituée d'ADN étroitement enroulé autour de protéines histones30.

Les images s-SNOM à plus haute résolution (Fig. 2a (i et ii)) révèlent des structures que nous identifions comme ER et Mt, visibles à cette longueur d'onde en raison de leur teneur en protéines et en acides nucléiques31,32. Une morphologie similaire est observée dans les images TEM de ER et Mt sur la Fig. 2c (i et ii), soutenant une fois de plus notre identification.

La figure 2d montre un balayage linéaire du signal s-SNOM le long de la ligne rouge de la figure 2aii, qui traverse le bord d'une mitochondrie. Le profil spatial est moyenné sur une largeur de 6 nm (3 pixels) et démontre une résolution spatiale de ≈30 nm. Ce niveau de résolution spatiale est couramment atteint avec ces échantillons biologiques (Fig. 3 supplémentaire), mais nous nous attendons à ce qu'une optimisation supplémentaire de la technique d'imagerie améliore cette résolution. Par exemple, des résolutions s-SNOM jusqu'à ~ 5 nm ont été signalées avec des échantillons inorganiques utilisant des sondes sur mesure plus pointues33.

La figure 3a est un spectre d'absorption en champ lointain de sections de cellules de myélome qui ont été préparées avec un protocole inclus dans la paraffine fixée au formol (FFPE), sectionnées à une épaisseur de 1 µm, puis déparaffinées de telle sorte que l'absorption mesurée n'a pas un contribution du milieu d'enrobage. Nous utilisons ce spectre d'absorption en champ lointain pour éclairer notre choix de longueur d'onde pour la cartographie chimique avec s-SNOM.

a Spectre d'absorption de sections de cellules de myélome déparaffinées fixées au formol et incluses en paraffine (FFPE). b (i – iv) Images s-SNOM d'une seule cellule de myélome acquises aux longueurs d'onde de chacune des bandes indiquées en (a). Barres d'échelle 2 μm.

Les bandes d'absorption amide I et II sont des agrégats de nombreux modes vibrationnels présentés par les fragments amide et sont couramment utilisées en spectroscopie IR pour analyser la teneur en protéines d'échantillons34, y compris dans des études à l'échelle nanométrique avec s-SNOM10,14. La bande phosphodiester (PO2) correspond aux fractions PO2 présentes dans les squelettes des acides nucléiques et des phospholipides. Sa concentration relative peut être utilisée comme biomarqueur fiable du cancer35. La bande marquée C – O est principalement composée de modes vibrationnels C – O dans le ribose, le sucre à cinq carbones des acides nucléiques, ainsi que de lipides et de glucides. Bien qu'une variété de macromolécules puisse également contribuer à l'absorption dans les bandes PO2 et C–O dans différentes régions cellulaires, elles sont toutes deux couramment utilisées34 pour analyser la teneur en acides nucléiques dans la région nucléaire. Nous notons qu'une grande partie du contenu lipidique est éliminée des cellules lorsqu'elles sont nettoyées avec du xylène, ce qui explique l'absence de pic d'absorption à environ 1730 cm-1. Pour être complet, un spectre d'absorption pour les cellules de myélome incluses dans la résine utilisées pour l'imagerie s-SNOM est présenté dans la Fig. 4 supplémentaire.

La figure 3b montre la cartographie chimique d'une seule cellule de myélome à des longueurs d'onde représentant chacun des quatre pics d'absorption de la figure 3a. La figure 3bi, au pic de l'amide I, sert principalement de moyen de cartographier la densité protéique dans toute la cellule, bien qu'il existe également des contributions des nucléobases. L'omniprésence des protéines dans les cellules fait que la cellule entière présente une forte absorption par rapport à la résine d'enrobage, qui n'absorbe que faiblement à cette longueur d'onde.

L'absorption la plus forte est observée dans les structures denses en protéines telles que le nucléole et la membrane nucléaire, comme sur la figure 2a. La figure 3bii cartographie également les structures contenant des amides, ici en utilisant une longueur d'onde dans la bande amide II. Les mêmes structures sont observées dans la cellule mais à des niveaux d'absorption globaux inférieurs, correspondant à la différence de hauteur de pic dans le spectre d'absorption de la figure 3a.

Les figures 3b (iii et iv) sont des cartes chimiques acquises avec des longueurs d'onde dans les bandes PO2 et C–O, respectivement. Aux deux longueurs d'onde, une forte absorption se produit près de la membrane nucléaire et à la périphérie des nucléoles, que nous attribuons principalement aux acides nucléiques densément emballés dans la chromatine30. Le cytoplasme et les nucléoles présentent une absorption plus importante à 1235 cm-1 qu'à 1020 cm-1. Nous attribuons cela à la présence de phospholipides29, qui ont de nombreux modes vibroniques actifs à 1235 cm−1, mais beaucoup moins à 1020 cm−1 au bord de la bande C–O34. Nous supposons donc que 1020 cm-1 est la longueur d'onde d'imagerie la plus appropriée pour isoler les acides nucléiques.

Des cartes chimiques à plus haute résolution avec des longueurs d'onde d'imagerie dans les bandes amide I et C – O sont présentées sur les figures 4a, b, respectivement. Cette cellule semble être binucléée, comme on l'observe fréquemment dans les cellules de myélome multiple36,37,38,39, avec deux nucléoles denses en protéines et des membranes nucléaires visibles sur la figure 4a. Une image à plus fort grossissement de l'un des nucléoles (Fig. 4a (i)) montre plusieurs structures en forme de fer à cheval avec une densité d'amide élevée qui entourent des zones de densité d'amide plus faible. Nous les identifions comme des composants fibrillaires denses (DFC) et des centres fibrillaires (FC), respectivement40. Le reste du nucléole est constitué d'un composant granuleux40. Les images TEM à fort grossissement des nucléoles (Fig. 5 supplémentaire) montrent également des DFC et des FC, soutenant notre identification. Des images supplémentaires à fort grossissement de nucléoles acquises avec s-SNOM sont présentées dans les figures supplémentaires. 6 et 7. Fait intéressant, les DFC ne sont pas visibles sur la Fig. 4b (i), ce qui suggère qu'ils présentent peu d'absorption à une longueur d'onde de 1020 cm−1. Ceci est confirmé sur la figure 4c par les profils spatiaux du signal s-SNOM aux deux longueurs d'onde d'imagerie sur un DFC (ligne magenta sur la figure 4a (i)).

Cartographie chimique s-SNOM d'une seule cellule de myélome avec des longueurs d'onde d'imagerie dans les bandes amide I (a) et C – O (b). Les encarts a(i) et b(i) montrent les structures plus en détail. Centre fibrillaire FC, composant fibrillaire dense DFC. Profils spatiaux du signal s-SNOM le long des lignes magenta (c) et verte (d) aux deux longueurs d'onde d'imagerie moyennées sur une largeur de 75 nm (5 pixels). Barres d'échelle 3 µm (a, b) et 500 nm (a(i), b(i)).

Remarquablement, il existe également des régions à haute densité d'acide nucléique, indiquées par des flèches cyan sur la figure 4b (i), qui ne sont pas détectées dans la cartographie des amides sur la figure 4a (i), ce qui suggère qu'elles ont une faible densité d'amide. Ceci est confirmé sur la figure 4d par les profils spatiaux du signal s-SNOM le long de la ligne verte sur la figure 4b (i). D'autres exemples d'isolement de sous-ensembles de structure cellulaire de cette manière sont présentés dans les Fig. 6 et 7. Dans la Fig. 8 supplémentaire, nous montrons que la signature IR de la résine d'enrobage n'altère pas sensiblement notre capacité à imager avec une spécificité chimique.

Nous avons utilisé s-SNOM pour effectuer une cartographie chimique sans étiquette de cellules eucaryotes, combinant l'imagerie à base de sondes à l'échelle nanométrique avec la sensibilité chimique de la spectroscopie IR. En inspectant la morphologie des cartes chimiques des cellules, nous avons identifié de nombreuses structures intracellulaires et validé cela en les comparant avec des images TEM à l'appui. À la connaissance des auteurs, cet article fournit les premières images optiques directes de sous-diffraction des centres ER, Mt, DFC et fibrillaires dans les nucléoles.

De plus, nous avons cartographié les protéines et les acides nucléiques dans les cellules en ciblant leurs signatures IR bien comprises et largement utilisées. Cela a permis d'isoler des sous-ensembles d'ultrastructure cellulaire, par exemple, des DFC riches en protéines et des régions à forte teneur en acide nucléique dans les nucléoles.

La quantification des structures intracellulaires - en nombre, taille et composition chimique - est un aspect important de la microscopie. Bien que cela soit possible avec des cellules marquées dans des techniques de fluorescence à super résolution, il a été démontré que la densité de marquage affecte à la fois le nombre de structures observées et leur taille apparente41. La nature sans étiquette de s-SNOM, d'autre part, signifie que la cartographie chimique peut être entièrement quantitative et sans ces biais d'étiquetage. En outre, la conversion des signaux s-SNOM en paramètres optiques couramment utilisés tels que l'indice de réfraction est également possible grâce à des algorithmes de traitement d'image13.

Nous pensons que cette capacité d'imagerie intracellulaire quantitative offre un potentiel considérable pour la découverte de biomarqueurs nanométriques de la maladie42, ainsi que pour la caractérisation de l'efficacité et des mécanismes de fonctionnement d'un large éventail de thérapeutiques, en particulier des médicaments tels que le bortézomib et l'osimertinib43, qui ont généralement des propriétés distinctes. signatures chimiques exploitables avec s-SNOM. La s-SNOM corrélative et la microscopie optique ont déjà été démontrées15, et nous nous attendons à ce qu'une corrélation supplémentaire avec EM soit également possible avec des adaptations des techniques actuelles44,45. Nous nous attendons donc à ce que s-SNOM puisse compléter les techniques de fluorescence EM et super-résolution pour aider à comprendre les mécanismes cellulaires dans divers domaines de recherche, y compris dans les réponses immunitaires telles que NETosis46.

À notre longueur d'onde de fonctionnement de ~6 µm, notre résolution de ~30 nm est déjà ~100 fois meilleure que la limite de diffraction. Étant donné que la résolution spatiale maximale réalisable dans s-SNOM est liée à la taille de la pointe de la sonde de balayage20, une meilleure résolution peut être attendue si une pointe plus nette est utilisée, mais au détriment du rapport signal/bruit de l'image. Les développements conduisant à une meilleure sensibilité de l'imagerie s-SNOM, par exemple en utilisant des nanoantennes IR8 ou des techniques d'amélioration de la pointe47, pourraient aider à atténuer ce problème de rapport signal/bruit. Nous nous attendons également à ce que l'expérimentation de schémas de préparation d'échantillons qui préservent mieux les informations morphologiques et chimiques verrait la résolution de l'image s'améliorer vers le ~ 1 nm rapporté dans les échantillons inorganiques48.

Étant donné que s-SNOM est réalisé dans des conditions ambiantes, avec seulement quelques milliwatts de puissance IR, les échantillons n'ont pas besoin d'être intégrés à la résine et la technologie doit être adaptée à l'imagerie de sections de style FFPE42. Ces derniers sont systématiquement préparés pour l'histopathologie à une fraction du temps et du coût des échantillons EM. Cela pourrait conduire à des applications cliniques importantes où donner aux histopathologistes un accès de routine aux informations ultrastructurales sans modifier le flux de travail pourrait considérablement améliorer la surveillance des marqueurs de la maladie.

Les cellules RPMI-8226 ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640, additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 μg/mL) comme l'ont fait Zlei et al.49. Les cellules ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection, vérifiées chaque année par une courte analyse répétée en tandem et testées pour les mycoplasmes tous les 3 à 4 mois.

Pour effectuer l'imagerie s-SNOM et TEM des cellules RPMI, 25 × 106 cellules ont été culottées, lavées dans 0,1 m de tampon acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) (pH 7,2), fixées avec 2,5 % de glutaraldéhyde dans HEPES pendant 2 h à 4 ° C et lavé 3 × 10 min avec HEPES. Ensuite, les pastilles ont été déshydratées dans une concentration graduée d'éthanol (50 %, 70 %, 95 % et sec 100 % v/v), 3 x 5 min, suivies de 3 x 10 min dans de l'acétonitrile (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni). Les échantillons ont ensuite été progressivement infiltrés avec des solutions à 50 %, 75 % et 100 % de résine Quetol (Sigma) dans de l'acétonitrile à température ambiante (2 h × 50 % de résine, une nuit × 75 % de résine et 2 changements de 100 % de résine sur trois jours) et durci à 60 °C pendant 24 h. Les échantillons sélectionnés ont été post-colorés avec de l'acétate d'uranyle à 5 % (UA, 5 min) et du citrate de plomb (LC, 3 %, 5 min), tous deux préparés dans de l'eau bidistillée. Les pastilles incluses ont été coupées à l'aide d'un ultramicrotome Leica UC7 (Leica, Autriche) avec un couteau diamanté à 35° (Diatome, Suisse) à une épaisseur de (70–200) nm. Les coupes ont été immédiatement collectées sur des grilles de cuivre TEM revêtues de carbone (Agar Scientific, Royaume-Uni) ou sur des puces de plaquettes de silicium (NanoAndMore), puis séchées et stockées jusqu'à leur utilisation ultérieure.

Pour obtenir un spectre d'absorption en champ lointain, des cellules RPMI-8226 ont été préparées avec un protocole FFPE standard. Un microtome Leica 1400 (Leica, Allemagne) avec une lame en acier inoxydable de 22° (S22, Feather, Japon) a été utilisé pour couper des sections à une épaisseur de 1 µm. Les coupes ont été placées sur une lame de fluorure de calcium et déparaffinées avec du xylène (2 × 3 min) suivi d'éthanol (100 %, 2 × 3 min).

Un système de microscope à champ proche commercial (neaSNOM, NeaSpec, Allemagne) équipé d'un système QCL (MIRcat-QT, Daylight Solutions, USA) avec quatre puces laser couvrant une gamme spectrale de \(\sim\)(900–1900) cm -1 a été utilisé pour l'imagerie s-SNOM. Un schéma de détection pseudohétérodyne25 a été utilisé pour obtenir des mesures de phase sans bruit de fond. Des sondes disponibles dans le commerce (Arrow NCPt, NanoWorld, Suisse) avec une fréquence de résonance \(\sim\)285 kHz ont été pilotées en mode tapping avec une amplitude \(\sim\)50 nm. Gwyddion a été utilisé pour le traitement d'image de base, comme la correction du bruit de ligne et l'extraction de profils de ligne à partir de données d'image.

L'imagerie TEM des cellules de myélome a été réalisée à 120 kV (JEOL 2100 TEM, JEOL).

Le spectre d'absorption en champ lointain des cellules de myélome a été obtenu avec un spectromètre IR à transformée de Fourier commercial (Vertex 70, Bruker, USA) avec un microscope IR Hyperion, fonctionnant en mode transmission.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les images s-SNOM et TEM sont disponibles dans le référentiel BioImage Archive avec le code d'accession S-BIAD612. Les données brutes des spectres d'absorption sont disponibles sur https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22277086.v1. Des informations supplémentaires sont fournies dans un document séparé.

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CCP et GEG reconnaissent le soutien financier d'EPSRC (EP/N509486/1, EP/R513052/1). HWA reconnaît le soutien de Cancer Research UK (C41494/A29035). CCP et DK reconnaissent le soutien de Cancer Research UK (C68186/A28503). Les auteurs remercient Sandra Iles pour la réalisation du bloc FFPE utilisé pour obtenir le spectre d'absorption en champ lointain des cellules de myélome multiple.

Experimental Solid State Group, Department of Physics, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

George E. Greaves, Darya Kiryushko et Chris C. Phillips

Département des matériaux et London Centre for Nanotechnology, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Darya Kiryushko & Alexandra E. Porter

Département d'immunologie et d'inflammation, The Hugh and Josseline Langmuir Centre for Myeloma Research, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Holger W. Auner

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Le projet a été conçu et coordonné par CCP et AEP Les cellules de myélome données par HWA ont été préparées en sections par DK Les images s-SNOM ont été acquises et analysées par GEG Les images TEM ont été acquises par DK Myeloma Des blocs FFPE ont été préparés pour être utilisés dans un spectromètre FTIR et ensuite mesuré par GEG L'article a été rédigé par GEG avec des contributions d'autres auteurs. Tous les auteurs ont lu et reconnu l'article.

Correspondance à George E. Greaves ou Chris C. Phillips.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Le Wang, Stefan Stanciu et Xiaoji Xu pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Chao Zhou et Manuel Breuer. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Greaves, GE, Kiryushko, D., Auner, HW et al. Cartographie à l'échelle nanométrique sans étiquette de la chimie des organites intracellulaires. Commun Biol 6, 583 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04943-7

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Reçu : 13 janvier 2023

Accepté : 15 mai 2023

Publié: 31 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04943-7

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